EXACTITUD
La exactitud es la concordancia entre un resultado y el valor de referencia aceptado. Se dice que un resultado es exacto si no presenta errores sistemáticos o si estos errores son aceptables.
Los errores sistemáticos provocan que la media de una serie de datos difiera del valor aceptado como verdadero. Las causas de este tipo de errores son:
-Interferencias, variaciones que se producen en la analito debido a otros componentes de la muestra.
-Errores personales.
-Errores instrumentales.
Los errores personales se evitan con un procedimiento de trabajo adecuado. Los instrumentales haciendo una calibración y un mantenimiento periódico de los componentes del instrumento analítico. Y las interferencias se evitan con un desarrollo adecuado de la metodología analítica, realizando determinaciones blanco. Una disolución blanco contiene todos los reactivos que se van a usar, menos la muestra, y se añade agua destilada.
La exactitud de un método analítico se puede evaluar de varias formas:
-Usando materiales de referencia
-Utilizando métodos de referencia
-Preparando una muestra de referencia en el laboratorio que contenga una matriz similar a la muestra que se quiere analizar y una cantidad conocida del analito que se quiere determinar.
-Haciendo ejercicios de comparación entre laboratorios, se manda parte de la muestra a otro laboratorio para que la analice (laboratorio de referencia)
Materiales de referencia
Los materiales de referencia certificados desempeñan un papel crítico en la validación de la exactitud de los datos de nutrientes para las muestras de alimentos. Un número de CRMs de matrices con diferentes composiciones han sido asignados a diferentes concentraciones de varios nutrientes, junto con intervalos de incertidumbre asociados (IU) para esos valores. Estos CRMs se han utilizado ampliamente en el departamento de Estados Unidos (USDA) en curso Nacional de Alimentación y Programa de Análisis de nutrientes (NFNAP Agricultura) para vigilar la exactitud de los ensayos de los alimentos y los nutrientes claves que se consume en los Estados Unidos. Un total de 690 valores asignados por los nutrientes individuales, incluyendo a las vitaminas, macroelementos, microelementos, ácidos grasos o aminoácidos, se reunieron a partir de los certificados de análisis para 63 CRMs, y los intervalos de incertidumbre asociados específicos en cada caso se expresaron como porcentaje de los certificados asignados o la concentración de referencia. En todos los nutrientes, el 63,5% de los IU de usuario eran menos del 10% del valor asignado, el 25,5% fueron del 10-20%, y el 11% eran mayores de 20% del valor asignado. Los IU de usuario para minerales y oligoelementos fueron más consistentemente inferiores al 10% del valor asignado. Las incertidumbres relativas fueron significativamente más altas para vitaminas, lo que sugiere un mayor reto en la medición y certificación de estos componentes. Estas altas IU (superior al 10% el valor asignado) en los mejores materiales de referencia certificados son mejores para indicar la precisión y exactitud que utilizando los sistemas actuales de medición de estos componentes. Estos datos sugieren que se debe tener cuidado en la elección de CRMs para supervisar el análisis de composición de alimentos, incluida la evaluación de lo que los niveles de incertidumbre se requieren en los valores asignados y que los sistemas de medición analítica de los componentes de alimentos necesitan un examen más detallado.
El material de referencia que se utiliza para certificar la exactitud de los análisis en la determinación de vitamina C en zumos de frutas se utiliza BCR-421:
1) Este valor es la media no ponderada de los medios de p, aceptan los conjuntos de resultados obtenidos por los distintos procedimientos de preparación de muestras y técnicas analíticas. Los valores tienen su origen en el Sistema Internacional de Unidades (SI).
2) La incertidumbre se toma como la mitad de la anchura del intervalo de confianza del 95% de la media que se define en (1).
3) Expresado en forma de clorhidrato de tiamina cloruro.
4), expresada como clorhidrato de piridoxina.
5) aumento de la incertidumbre, el 1,5% calculado (la mitad de ancho del intervalo de confianza del 95% de la media) se consideraban demasiado bajas, por lo tanto, la incertidumbre calculada de este analito en la BCR-431 (las coles de Bruselas) fue tomada (5%) .
6) aumento de la incertidumbre para permitir la falta de homogeneidad posible.
Este certificado tiene una validez de un año después de la compra.
Ventas día:
El importe mínimo de la muestra que se utilizará para cada vitamina es: 2 g en el caso de las vitaminas B y vitamina C, 5 g de ácido fólico y niacina, y 10 g de vitaminas D3 y E.
Este material ha sido certificado por el BCR (Oficina comunitaria de referencia, los materiales de referencia anterior programa de la Comisión Europea). El certificado ha sido revisada bajo la responsabilidad del IRMM.
DESCRIPCIÓN DE LA MUESTRA
BCR-421 es un enriquecido vitaminado secado por aspersión de leche en polvo que está empaquetado en grado alimenticio, bolsitas de aluminio sellado al calor. Cada sobre contiene aproximadamente 50 gramos de material. El material está destinado a ser utilizado para la calibración y verificación de funcionamiento de un método analítico.
MÉTODO ANALÍTICO UTILIZADO PARA LA CERTIFICACIÓN
En el caso de la vitamina C se usa:
-Fase invertida HPLC con detección fluorimétrica, ultravioleta o electroquímica.
- Fluorimétrica (tras derivatización con o-fenilendiamina).
PARTICIPANTES
- Agricultural Research Centre of Finland, Jokioinen (FI)
- Aspland & James, Chatteris (GB)
- Bretby Analytical Consultants, Burton-upon-Trent (GB)
- Central Sciences Laboratory, Food Sciences Laboratory, Norwich (GB)
- CERNIP, Institut Pasteur de Lyon (FR)
- Departamento da Sanidad, Laboratoire Salud Publica Bizkaia, Bilbao (ES)
- Department of Applied Chemistry & Microbiology, University of Helsinki (FI)
- Department of Applied Nutrition & Food Chemistry, Lund (SE)
- Department of Nutrition, University College, Cork (IE)
- F. Hoffmann La Roche Ltd., Basel (CH)
- Facultad de Farmacia, University of Valencia (ES)
- IGB Keuringsdienst van Waren, Maastricht (NL)
- Institut fur Chemie und Biologie (BFE), Stuttgart (DE)
- Institut fur Wirkstoffprufung, Kiel (DE)
- Institute of Food Research, Norwich (GB)
- Laboratory of the Government Chemist, Teddington (GB)
- Masterlab, Putten (NL)
- National Food Administration, Uppsala (SE)
- National Food Agency of Denmark, Soborg (DK)
- Paediatrics & Child Health, University of Leeds (GB)
- Pedigree Pet Foods, Melton Mowbray (GB)
- Schweizerishes Vitaminstitut, Basel (CH)
- TNO Nutrition & Food Research Institute, Zeist (NL)
- Unilever Research Colworth Laboratory, Bedford (GB)
- University Louis Pasteur, Strassburg (FR)
- VTT Biotechnology and Food Research, Espoo (FI)
- Yiotis S.A., Athens (GR)
Los valores certificados se expresan en base seca. La corrección de materia seca debe hacerse sobre una sub-muestra de separar el contenido del sobre de mismo modo que se analiza la vitamina, y se debe hacer de forma paralela al análisis de vitaminas. La corrección de materia seca se determinó después de secar a presión atmosférica en un lugar bien ventilado horno a 103 º C ± 2 º durante 2 horas. La temperatura debe ser uniforme en todo el horno. La pérdida de la materia se expresa como un porcentaje en la materia de la muestra .
La incertidumbre declarada se aplica cuando el material de referencia se utiliza para la calibración, o para verificar la validez de una curva de calibración.
ALMACENAMIENTO
Las muestras deben mantenerse sin abrir a temperaturas no superiores a - 30 º C. Sin embargo, la Comisión Europea no se hace responsable de los cambios que se producen durante el almacenamiento del material en las instalaciones del cliente, en especial de las muestras de apertura.
DETERMINACIÓN DE LA VITAMINA C (ácido ascórbico)
CONTENIDA EN UN BATIDO O ZUMO DE FRUTA.
El ácido ascórbico (L-ascórbico) o vitamina C es una -lactona sintetizada por las plantas y casi todos los animales, a excepción de los primates y las cobayas.
Su deficiencia prolongada en la dieta de los humanos origina una enfermedad conocida como escorbuto, caracterizada por la aparición de lesiones cutáneas, fragilidad de los vasos sanguíneos y una mala cicatrización de las heridas. Además, el ácido ascórbico es un potente antioxidante natural que se encuentra presente en grandes cantidades en los zumos cítricos y de muy extensa aplicación como aditivo alimentario. No obstante, en los productos manufacturados y con la exposición de éstos al oxígeno atmosférico, la vitamina C se ve sometida a un proceso continuo de oxidación. Es un reductor que se oxida con cierta facilidad, en presencia de oxidantes suaves, para dar ácido dehidroascórbico.
Esquemáticamente se puede escribir la ecuación en la forma:
Los métodos químicos para la determinación de ácido ascórbico se basan principalmente en su carácter reductor. Uno de ellos, rápido y de elevada fiabilidad, es la valoración del ácido con disolución de N-bromosuccinimida (NBS) que actúa como agente oxidante, convirtiendo los alcoholes secundarios en cetonas (lo que da lugar al ácido dehidroascórbico), para reducirse, de forma irreversible, a succinimida y bromuro de hidrógeno. La reacción, cuantitativamente, es equimolecular y responde a la ecuación
La reacción anterior es muy rápida en comparación con la que pudiera darse con muchas de las sustancias que pudieran interferir la valoración, lo que determina la elevada fiabilidad del método.
La NBS es capaz de liberar iodo al reaccionar con el ioduro de potasio en medio ácido (etanoico o acético), pero en presencia de ácido ascórbico oxida a éste primero. Si ambas sustancias se encuentran en disolución hasta que no se oxide totalmente el ascórbico no empezará a liberarse iodo por oxidación del ioduro. Un ligero exceso de NBS, una vez oxidado todo el ascórbico, dará lugar a la aparición de iodo en la disolución, lo que podrá detectarse añadiendo previamente unas gotas de disolución de almidón con el que el yodo forma un complejo característico de color azul o violeta (según donde se encuentre el ascórbico).
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Para poder determinar el porcentaje de vitamina C en la muestra problema (zumo de frutas) habrá que conocer el volumen de disolución de NBS necesario para que ésta reaccione con todo el ácido ascórbico contenido en distintos volúmenes de una disolución del ácido de concentración conocida, lo que permitirá relacionar, de forma gráfica, la cantidad de ascórbico con el volumen de la disolución de NBS utilizado para la valoración estequiométrica (estandarización de la NBS).
Para ello, tomar, mediante la pipeta adecuada, 0,6 mL de la disolución 0,2 M de ácido ascórbico (masa molecular 176,13 g mol-1) que se facilita y llevarlos a un matraz aforado de 100 mL, completando con agua destilada hasta el aforo del matraz.
De la disolución resultante tomar, en sendos vasos, volúmenes de 8, 6, 4, 2 y 1 mL. Rotular los vasos con los números 1, 2, 3, 4 y 5. Anotar, en la hoja de respuestas, las cantidades de ácido ascórbico presentes en cada vaso (completando la tabla). Añadir a cada uno de ellos
1 mL de disolución de ioduro de potasio al 4%,
0,4 mL de disolución de ácido acético al 10%,
3 gotas del la disolución de almidón y
unos 6 mL de agua destilada.
Llenar la bureta con la disolución de NBS (masa molecular 177,99 g mol-1) y enrasar a cero. Tomar uno de los vasos con disolución de ácido ascórbico, colocar en él el núcleo de agitación, poner el vaso encima del agitador y comenzar una agitación suave. Dejar caer lentamente la disolución de NBS de la bureta hasta que se observe que las gotas producen estela. Añadir 2 gotas más de la disolución de almidón y dejar que caiga la NBS gota a gota hasta que persista el color azul o azul-violeta en la disolución contenida en el vaso. Repetir la valoración con el resto de los vasos preparados.
Anotar, en la hoja de respuestas, los volúmenes de la disolución de NBS que en cada caso se han necesitado para alcanzar el punto de equivalencia.
Representar en una gráfica los gramos de ácido ascórbico que contenía cada vaso frente al volumen de disolución de NBS que ha sido necesario para su completa valoración.
Pesar, en un vaso limpio y seco, aproximadamente 1 g del zumo de fruta. Añadir un poco de agua destilada y poner las cantidades de las disoluciones de KI, ácido acético y almidón indicadas anteriormente. Valorar ahora esta disolución con la de NBS. Repetir la valoración con nueva cantidad de zumo. De acuerdo al volumen gastado, encontrar los gramos de ácido ascórbico que contiene el zumo de fruta y determinar su porcentaje en peso.
PRECISIÓN
- La precisión es el grado de concordancia entre los resultados obtenidos al aplicar repetida e independientemente la misma metodología analítica a la muestra.
- La precisión está relacionada con los errores aleatorios, estos errores hacen que los resultados se desvíen del valor medio; por lo que un resultado será preciso cuando no presente este tipo de errores.
- La precisión de un método analítico se determina realizando un número determinado de réplicas (normalmente 11) de la muestra.
- Con los datos experimentales obtenidos se tiene que calcular la desviación típica o varianza y el método que presente menor varianza será el más preciso.
Gracias a los resultados obtenidos podemos calcular el coeficiente de variación, y este tendrá que ser menor del 5% para que se considere un método preciso.
Con los obtenidos se puede realizar un test de comparación de varianzas, con el se demuestra si el método analítico es realmente preciso o no, este test se llama test F de dos colas.
- Relacionados con la precisión también es importante hablar de repetibilidad y reproductibilidad.
Repetibilidad: es la precisión bajo condiciones en que los resultados de ensayos independientes se obtienen con el mismo método, con el mismo operador, utilizando el mismo instrumento de medida y durante un corto intervalo de tiempo.
Reproductibilidad: es la precisión bajo condiciones en que los resultados de ensayos independientes se obtienen mediante el mismo método pero con diferentes condiciones (diferentes laboratorios, diferentes instrumentos analíticos, diferente analista, etc…)
VALIDACIÓN DEL MÉTODO: DETERMINACIÓN DE VITAMINA C TOTAL POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN “HPLC”
- El método de determinación de vitamina C total utilizando cromatografía líquida de alta resolución “HPLC”, fue validado utilizando varias matrices. Incluye la extracción con una disolución al 3% en ácido metafosfórico y al 8% en ácido acético. El ácido ascórbico es separado en una columna C18 utilizando un buffer de fosfatos como fase móvil y un detector UV a 254 nm. Los parámetros de validación confirman que el método es adecuado para determinar vitamina C total en frutas frescas, jugos y colados de frutas.
- La desviación estándar relativa (DER %) para todas las muestras fue < 10%.
- La cromatografía es específica para vitamina C total y se utiliza en productos considerados como buenas fuentes de esa sustancia. Los métodos cromatográficos que hasta hoy se conocen están limitados porque la vitamina C se presesenta naturalmente, en muchos alimentos, como ácido ascórbico ( AA ) y ácido deshidroascórbico (DHAA) y a menos que el DHAA sea convertido a AA, los resultados obtenidos pueden ser bajos cuando se analiza solo la forma reducida.
Debido a la importancia que tienen ambas formas activas de esta vitamina para el ser humano, la cuantificación tanto del ácido ascórbico como el deshidroascórbico en frutas y derivados de frutas, que son fuentes ricas de vitamina C, es preciso contar con un método validado en donde se puedan analizar simultáneamente las dos formas activas de esta sustancia.
- Parte experimental:
El método consiste en la extracción del ácido ascórbico (AA) y el dehidroascórbico (DHAA) con reactivos y condiciones que eviten al máximo su deterioro.
El extracto es analizado por cromatografía líquida de alta resolución donde los dos compuestos se separan y cuantifican simultáneamente. El ácido ascórbico se detecta y cuantifica por espectrofotometría ultravioleta mientras que el dehidroascórbico se cuantifica por la formación de un derivado poscolumna que se detecta por fluorescencia. La cuantificación e identificación de los ácidos se realiza inyectando patrones de concentración conocida, los cuales se utilizan para calibrar el equipo en cuanto a concentraciones y para la identificación de los tiempos de retención.
Los parámetros analizados para la validación de este método fueron los siguientes:
• Linealidad
• Ámbito (10-200 mg/L)
• Veracidad (% recuperación)
• Precisión (RSDr %)
• Límite de detección
• Límite de cuantificación
- Extracción
Durante todas estas etapas, se protegió la muestra de la luz para evitar el deterioro de la vitamina recubriendo los recipientes con papel aluminio.
• Jugos de frutas: Se pesó por heptaplicado, 25 mL en un balón de 100 mL y se llevó a volumen con la disolución extractora de trabajo. Se filtraron por microporo (0,45mm) y se inyectaron.
• Frutas frescas y colados de frutas:
Se pesaron por heptaplicado 20 g en un balón de 100 mL (para colados) y 25 g (para frutas frescas) y se llevó a volumen con la disolución extractora de trabajo. Una vez aforadas, las disoluciones se trasvasaron a botellas para centrífuga, en el agitador mecánico se agitaron vigorosamente durante 30 minutos. Se dejaron reposar por una hora y luego se centrifugaron por 15 minutos a 4.000 rpm. Las disoluciones se filtraron por microporo (0,45μm) y se inyectaron.
Las condiciones utilizadas fueron:
• Temperatura del reactor: 100ºC
• Presión de reactivo: 400 psi
• Presión poscolumna: 150 psi
• Longitud de onda emisión: 430 nm
• Longitud onda excitación: 350 nm
Una vez que el equipo alcanzó las condiciones indicadas, se procedió a inyectar los patrones y luego las muestras.
- Cuantificación Validación de las curvas de calibración
En este cuadro se presenta la preparación de la curva de calibración.
Para la validación de la curva se prepararon 5 disoluciones madre, independientes de 1.000 ppm de ácido ascórbico y se construyó la curva de calibración con 6 patrones que se encontraban en el ámbito 10-200 ppm. Se hizo la curva de calibración de los puntos inyectando aleatoriamente los patrones A, B, C, D, E y F de cada disolución madre.
- Cálculo de concentraciones
El valor de la concentración en la muestra se estimó interpolando el área a partir de la regresión de la curva de calibración. La concentración del ácido ascórbico y del dehidroascórbico se calculó utilizando la siguiente fórmula:
mg/100g = Cn interp * 10/masa muestra
Se calculó el promedio, la desviación estándar y el coeficiente de variación para las muestras y se reportó el contenido de vitamina C total como la suma de los dos ácidos analizados.
- Repetibilidad
Se prepararon por separado muestras sólidas y semisólidas de frutas frescas, y se inyectaron una por una. Luego se determinó la desviación estándar de los resultados.
- Factor de recuperación
Para comprobar la veracidad del método se realizaron pruebas de recuperación, pesando una cantidad de muestra cuyo peso fue la mitad del de las muestras analizadas. Se agregó una cantidad del patrón de ácido ascórbico de 1.000 ppm de modo que la concentración final fuera del mismo orden de la concentración del analito sin marcar.
- De acuerdo con el ámbito de trabajo establecido, se realizó el análisis estadístico utilizando el método de ajuste de mínimos cuadrados clásicos para efectuar las mediciones de los patrones y de las muestras. En los Gráficos 1 y 2 se muestran la recta de mejor ajuste, el ámbito de linealidad y el coeficiente de correlación para la curva del AA y la del DHAA.
GRÁFICAS 1 Y 2:
- En el estudio de validación del método se evaluaron tres tipos de muestras: jugos de frutas, frutas frescas y colados o purés de frutas. La veracidad del método fue comprobada por medio del porcentaje de recuperación. En la Cuadro 2 se presentan los resultados junto con la desviación estándar relativa, expresada como porcentaje (DER).
- La repetibilidad del método se determinó como la desviación estándar relativa de siete réplicas, analizadas bajo condiciones idénticas y en el mismo día. Los resultados se observan en la Cuadro 3. En todos los casos el resultado fue menor del 10%, límite establecido para aceptar los resultados del análisis.
