Límite de detección y límite de cuantificación.
Determinación de Vitamina C
Determinación de ácido ascórbico mediante el Método de Tillmans (Titulación de 2,6 – Dicloroindofenol).
1. Preparación de soluciones:
a. Ácido metafosfórico-acético:
Para 500ml, se pesó 15g de ácido metafosfórico y se le añadió 40ml de ácido acético y 200ml de agua destilada para disolver, luego se llevó a volumen de 500ml y se filtró la solución. La solución tiene duración de una semana una vez preparada.
b. Solución de Indofenol (Tinte para titular)
Para 200ml, se pesó 50mg de 2,6-dicloroindofenol y se disolvieron en 50ml de agua destilada y se pesó 42mg de Bicarbonato de sodio, se agita vigorosamente y luego de disolverse se lleva a volumen de 200ml y se filtra la solución. La solución tiene duración de una semana una vez preparada.
2. Estandarización del tinte:
Se colocaron 2 ml de solución de ácido ascórbico estándar (1 mg/ml) en tres diferentes matraces de 50 ml cada uno, conteniendo 5 ml de solución de ácido metafosfórico – acético. Se tituló cada uno con la solución de indofenol hasta obtener un color rosado que persistiera por 5 segundos. Simultáneamente se titularon 3 blancos, los cuales consistían de 7 ml de la solución de ácido metafosfórico - acético llevado a volumen de 15 ml con agua destilada.
3. Preparación de la muestra:
Se obtuvieron 2 ml de la muestra y se pesaron, se añadieron a un matraz (50ml) con 5 ml de ácido metafosfórico acético. NOTA (Si la muestra permanecía con mucho color se añadían 20 ml de agua y 5 ml de metafosfórico acético). Se tituló con la solución de indofenol hasta obtener un color rosado que persistía por 30 segundos.
4. Contenido de ácido ascórbico
Fórmula:
Donde: C = mg de ácido ascórbico/ml tinte
V = ml tinte para titular muestra
FD = factor de dilución utilizado
Límites de detección y cuantificación
Los límites de detección y cuantificación son parámetros que determinan la capacidad de análisis de un método analítico en unas condiciones de mayor sensibilidad que permite el sistema informático. El límite de detección es la mínima concentración de analito en una muestra que se puede detectar en un proceso de análisis con un nivel aceptable de confianza, pero no necesariamente cuantificada. El límite de cuantificación es la concentración mínima de analito que puede determinarse con un nivel aceptable de exactitud y precisión.
Límite de detección (LOD): es la concentración de analito que proporciona una señal en el
instrumento (YLOD) significativamente diferente de la señal del blanco o “ruído de fondo”. Se puede definir como la concentración de analito que proporciona una señal igual a la señal del blanco, YB, más tres veces la desviación estándar del blanco, SB.
Límite de cunatificación (LOQ) o límite de determinación: es el límite inferior para medidas cuantitativas precisas, como opuesto a la detección cualitativa. Se puede definir como la concentración de analito que proporcion una señal (YLOQ) igual a la señal del blanco, YB, más diez veces la desviación estándar del blanco, SB.
Para la obtención de los límites de detección y cuantificación se preparó una disolución madre que contenía todos los compuestos patrón en concentraciones de 25 ppm. A partir de ésta se prepararon otras disoluciones por dilución con metanol acidificado con HCL al 0,1% de todos los patrones desde 16 ppm hasta 0,0078 ppm, debido a que a esta concentración no se aprecian picos en el cromatograma.
El límite de detección y el límite de cuantificación definen la sensibilidad, que es la mínima cantidad de analito que puede producir un señal significativo.
Límites de determinación y cuantificación en la determinación de vitamina C en uchuva por cromatografía líquida de alta resolución (CLAR)
Los resultados obtenidos en la determinación de vitamina C se evaluaron, calculando la recta de regresión para definir la respuesta a concentración cero por extrapolación al origen de la recta. Posteriormente se determinó SB que corresponde a la desviación estándar del intercepto. Así, YLOD es la concentración mínima de analito que puede detectar el espectrofotómetro UV-Vis a 265 nm. El LOD para la determinación de vitamina C fue de 0,241 mg/L, (Otras técnicas, como la espectrofotométricas, manejan LOD de 3,2 mg/L con niveles de azúcares menores del 0,15 %).
El valor determinado de LOQ fue de 0,3505 mg/L. De acuerdo con este parámetro, es posible indicar que la técnica de cuantificación por CLAR para la vitamina C mediante curva de calibración, presentó sensibilidad.
SENSIBILIDAD:
La sensibilidad expresa la respuesta del instrumento analítico para una concentración determinada de analito.
Un método analítico será más sensible cuanto mayor sea la variación de la señal analítica “y” para una variación de la concentración del analito “x” dada.
La sensibilidad (S) de un método viene dada por la pendiente de la curva de calibrado.
y = mx + b
La sensibilidad de un método analítico se relaciona con la cantidad mínima de analito requerida para dar un resultado significativo, cualitativo o cuantitativo.
Debe distinguirse entre sensibilidad de calibrado y sensibilidad analítica.
- Sensibilidad de calibrado: corresponde a la pendiente de la recta de calibración, es decir, la señal o respuesta por unidad de concentración.
- Sensibilidad analítica: corresponde a la sensibilidad de calibrado dividida por la desviación estándar de la respuesta.
Los parámetros a definir para poder evaluar la sensibilidad de un método analítico son los limites de detección y de cuantificación.
Los pasos a seguir son los siguientes para la determinación de la vitamina C con respecto a la sensibilidad son:
- Se determina la pendiente de la curva de calibración (concentración v/s respuesta) en el rango apropiado.
- Se realiza otra curva de calibración, inyectando cada punto por triplicado, pero en este caso para concentraciones menores de analito, determinándose la ecuación de esta nueva recta de calibración y se extrapola la respuesta a concentración cero, obteniéndose un estimado de la respuesta del blanco.
- Se determina la desviación estándar correspondiente a cada concentración del punto 2, se calcula la recta correspondiente a concentración v/s s y se extrapola como en el caso anterior la desviación estándar a concentración cero, obteniéndose el estimado correspondiente a la desviación estándar del blanco.
Recta de calibrado:
La recta de calibrado es un metodo sencillo para determinar concentraciones a partir de las señales proporcionadas por el instrumento analitico.
En este caso se analizan diluciones de un patrón de concentración conocida con los datos obtenidos se realiza una recta en la que se enfrente señal y concentración. La recta tendrá una ecuación en la cual sabiendo la señal, podemos despejar la concentración.
