tarea 4

TÉCNICAS DE SEPARACIÓN






En la determinación de vitamina C en zumos de frutas se pueden usar diversas técnicas para la separación de la vitamina C de la muestra. Todas estas técnicas se incluyen en las operaciones previas del proceso analítico y tienen como objetivo:
-Mejorar la selectividad, eliminación de interferencias.
-Mejorar indirectamente la sensibilidad, preconcentración.

Algunas de las técnicas de separación más usadas para la vitamina C son: cromatografía líquida (HPLC), utilizando una titulación con disolución yodo estándar, utilizando ácido metafosfórico y por fase sólida espectrofotométrica.





EXTRACCIÓN DE VITAMINA C CON ÁCIDO METAFOSFÓRICO




Se basa en utilizar como extractante una disolución acuosa de ácido metafosfórico al 0,4%. El extracto se filtra y se purifica mediante extracción en fase sólida sobre C18.





SEPARCIÓN DE VITAMINA C UTILIZANDO YODO




La vitamina C (ácido ascórbico) es un agente reductor que se puede determinar por medio de una titulación con solución yodo estándar.

Como materiales y reactivos se utilizan:

- Matraz aforado 250 mL
- Pipeta aforada 10 mL
- Yoduro potásico.
- Pipeta graduada 10 mL
- Tiosulfato sódico 0,1 N. (ver anexo)
- Erlenmeyer 250 mL (2).
- Acido Clorhídrico 37%
- Bureta.
- Almidón disolución al 1 % (ver anexo)
- Mortero
- Yodo 0,1N (ver anexo)
- Dicromato de Potasio
- Ácido Sulfúrico
El procedimiento consiste en:


Antes de iniciar el práctico se debe estandarizar el yodo

•Tomar tres tabletas de vitamina C de 100 mg (Nota 1), y triturarlas con mortero.
•Pesar con exactitud toda la muestra y colocarla en un matraz erlenmeyer de 250 ml.
•Disolver las tabletas en cerca de 50 ml de agua, agitar el matraz con movimientos circulares hasta la total disolución de las tabletas (Nota 2).
•Agregar 5 ml de indicador de almidón y titular de inmediato (Nota 3)
•Repetir dos veces el procedimiento anterior.

Nota 1: 300 mg de ácido ascórbico deben necesitar cerca de 34 ml de I2 0,1 N para su titulación.
Nota 2: Una cantidad pequeña del excipiente de las tabletas no se va a disolver y permanecerá en suspensión.
Nota 3: Una solución de vitamina C se oxida con facilidad con el oxígeno del aire, así que la titulación debe realizar tan pronto como se disuelva la muestra

Para los cálculos hay que tener en cuenta que ya que la molécula de vitamina C pierde dos electrones en esta reacción, su peso equivalente es la mitad de su masa molar, 88,07 g/eq.





Preparación Solución de Yodo 0,1N:

•Pesar en la balanza cerca de 12,7 gramos de yodo colocarlos en un vaso de precipitados de 250 ml.
•Agregar en el vaso 40 gramos de yoduro de potasio y 25 ml de agua.
•Agitar para disolver todo el yodo y transferir la solución a un matraz aforado de un litro, evitando el traspaso de yodo no disuelto.
•Diluir hasta el aforo, y transferirlo a un frasco color ámbar (mantener alejada de la luz tanto como sea posible).




Valoración de la Solución de Yodo:



•Transferir alícuotas de 25 mL de la solución de Yodo en matraces de 250 mL y diluir hasta 50 mL.
•Agregar 1 mL de ácido sulfúrico 3,0 M
•Titular con el Sodio Tiosulfato hasta que la solución adquiera un color amarillo.
•Añadir 5 mL de Indicador de Almidón.
•Proseguir la titulación hasta que el color azul cambie a incoloro.
•Calcular la normalidad como el promedio de tres titulaciones que no difieran en más de 0,2 mL.




CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA




Es una técnica analítica empleada para la separación, identificación y determinación de diversas sustancias basada en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos
fases inmiscibles:
-una fase fija o estacionaria (sólida o líquida).
-una fase móvil (líquida o gas).
Se basa en diferencias existentes en la velocidad de migración de los distintos componentes de la muestra. Estas diferencias se establecen cuando los componentes de la muestra son arrastrados por la fase móvil a través de un soporte cromatográfico que contiene a la fase estacionaria.
La fase movil es líquida. Se trabaja a temperatura ambiente, por lo que es ideal para compuestos inestables térmicamente. Permite realizar de forma sencilla muchas de las determinaciones tanto de macroconstituyentes (carbohidratos, lípidos,...) como microconstituyentes (vitaminas, aditivos, residuos,...).
Hay etapas previas que incluyen la determinación del contenido de agua, así como la extracción y purificación de los extractos (muestras sólidas).
Los sistemas de detección utilizados son prácticamente todos los disponibles (Absorción molecular UV-Vis (fila de diodos), Fluorescencia molecular, Índice de refracción, Conductividad, Electroquímico y Espectrometría de Masas).




CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICACIA (HPLC)




Los componentes básicos del sistema de .HPLC. son: la bomba, el inyector, la columna de separación, el detector y el integrador. La bomba sirve para mover la fase móvil en forma controlada y precisa a través del sistema.
La muestra es introducida a la fase móvil a través del inyector donde el volumen a ser inyectado depende del tamaño del bucle loop.
La columna es la herramienta de separación que se conecta entre el inyector y el detector. El material de empaque de la columna analítica depende del tipo de analito y las condiciones de separación. Hay rellenos basados en sílica y otros basados en polímeros orgánicos. Para la separación de ácidos orgánicos en alimentos se han utilizado resinas sintéticas orgánicas formadas de estireno y divinilbenceno emulsionados.
El detector convierte los cambios en concentración del eluyente de la columna en señales eléctricas. Los más utilizados son detectores que se basan en espectrofotometría ultravioleta-visible (UV-Vis) y fluorescencia, determinación del índice de refracción y análisis electroquímico (Rounds y Gregory, 2003).
El detector de absorción de rayos ultravioleta-visible mide la absorción de la radiación por compuestos que contengan cromóforos donde la magnitud de la señal es directamente proporcional a la concentración del analito. La señal electrónica provista por el detector pasa al integrador donde permite la cuantificación de los picos en un cromatograma.










DETERMINACIÓN INDIRECTA DE VITAMINA C POR FASE SÓLIDA ESPECTOFOTOMÉTRICA



La técnica de espectrofotometría en fase sólida (SPS), en la región visible, se utilizó para la determinación espectrofotométrica del ácido ascórbico basado en el efecto sobre la reducción de hierro (III), seguido por la formación del hierro (II)-ferrozina quelato. El quelato es fácilmente absorbido en un gel de intercambio tipo aniónico dextrano y la absorbancia de la resina a 567 y 800 nm, envasados en un 1 mm celular, se mide directamente. La absortividad molar aparente con 100 ml de la muestra fue de 2,1x107 l mol-1 cm-1 y permitió la determinación de ácido ascórbico en el rango de 5-90 ng ml-1. El límite de detección fue de 0,91 ng ml-1 y el 0,91% RSD de concentración de 50 ng ml-1 de ácido ascórbico (n=10). El método propuesto permite una determinación del ácido ascórbico con una alta sensibilidad y selectividad sin preconcentración y ha sido satisfactoria para su determinación en los zumos de frutas, productos farmacéuticos, orina y líquidos conservadores.



Procedimiento


Una alícuota de una solución acuosa que contiene 0,6 ±7 microgramos de ácido ascórbico fue colocado en un tubo de vidrio de 25 ml con tapón, 1 ml de 1,26x10-4 mol l-1 de solución hierro (III), 1 ml de 1,17x10-3mol l-1 de solución de ferrozina y 1 ml de 0,25 mol l-1 solución tampón HMTA (PH=5,0) se han añadido. El volumen llega hasta 10 ml por adición de agua destilada. Se añade a la disolución 30 mg de Sephadex QAE A-25 resina de intercambio iónico y la mezcla se agita durante 15 min. La solución fue filtrada y los granos de resina fueron recojidos junto con un pequeño volumen de la solución y se colocan en una celda de vidrio de 1 mm con la ayuda de una pipeta. Por último, se midió la absorbancia a 567 y 800 nm. Un blanco de reactivo sin ácido ascórbico se prepara de la misma manera.





Aparatos


Un microprocesador GBC 911A el espectrofotómetro UV-VIS de GBC equipo científico Pty de 1 mm de celdas de vidrio óptico del STARNA fue utilizado para todas las mediciones de absorbancia.
Todos los espectros se registraron con una velocidad de barrido de 250 nm/min. El espectrofotómetro se controló por un microordenador BRAVO AST/30286 conectados por medio de un puerto serie para la adquisición de datos y el procesado de datos usando el programa SCAN MASTER V 1,62 (de GBC).
Un plotter PL80 COMX se utilizó para representaciones gráficas. Todas las mediciones de pH se han hecho con un Modelo Crison 2002 pH-metro con un vidrio saturado de electrodos de calomelanos y un sonda de temperatura. También se utilizó un agitador rotatorio Agitaser 2000.

Etapas en la preparación de la muestra



La extracción del zumo se debe hacer lo más rápido posible para minimizar la oxidación del zumo por encimas presentes en el. Se distinguen una serie de etapas en el proceso de extracción del zumo a partir de las frutas. De este zumo se tiene que tomar una muestra que debe ser representativa de todo el material. En el laboratorio la muestra sufre una serie de etapas para su preparación, pero en nuestro caso (zumos de frutas), las etapas que se realizan son menos que para otras substancias. En todas estas etapas se debe evitar la producción de errores por contaminación de la muestra (que lleguen a la muestra substancias que no contenía), por pérdida de analitos (en los trasvases que sufre el zumo) o por variación de la composición química de la muestra.
En ocasiones la muestra no se analiza inmediatamente, sino que se almacena durante un cierto tiempo o se envía a otro laboratorio para que sea elaborado. Así hay que desarrollar unos contenedores apropiados para evitar que se produzca la degradación o pérdida de analitos de la muestra. Pero aún así las muestras propensas a sufrir alteraciones deben ser analizadas inmediatamente. En nuestro caso el zumo de frutas permanece sin alterar durante tiempos pequeños, por lo que más recomendado es analizarlo al poco tiempo de preparar la muestra.
En la elaboración de los zumos de frutas se distinguen las siguientes etapas, que varían según el tipo de fruta que se este usando:





TRITURACIÓN

Se utilizan molinos de martillo para triturar la fruta completa en la preparación para el prensado. Se desintegra la fruta hasta que pase por una malla de tamaño predeterminado que se monta en el fondo del molino. Con las frutas firmes se debe usar mallas mas pequeñas y su tamaño será mas fino.
Los molinos de rejilla ofrecen un método alternativo para desintegrar la fruta. En este molino se pasa la fruta a través de un cilindro con cuchillos. Se ajusta la profundidad del corte en las frutas controlando la profundidad de los cuchillos del cilindro.
La extracción de jugo de naranja se basa en la remoción del jugo disponible (50% en peso) en la naranja. En el mercado se utilizan dos tipos de extractores, el FCM que es diseñado con un proceso de exprimido, donde se realiza una perforación en la naranja y se exprime la carne y el
jugo de la naranja. Otro extractor es el Brown Extractor, donde se parte la naranja en dos mitades y luego se extrae la carne y el jugo de cada mitad.

Técnica de Extracción por Arrastre y Vapor.
Esta técnica es valida para todas las frutas con excepción de los cítricos, que por su composición físico químico que acaban siendo alterados en su sabor por este método, que usa al calor y el vapor como fuente de extracción del jugo.
Este sistema consiste en accionar una fuente de calor con vapor desde abajo hacia arriba, para alcanzar los frutos con el vapor caliente, que hará su ablandamiento y destilación de sus frutos para extraer su jugo.











PRENSADO

Después de la trituración, la fruta desintegrada se aplasta para extraer toda la cantidad de zumo posible.
Prensa hidráulica de trapo: se utiliza un trapo de algodón o nylon pesado en el cual se echa una cantidad de la fruta desintegrada, luego se dobla para formar una tarta. Se agrupan varias tartas. Las tartas se separan por medio de una placa de madera, acero inoxidable o plástico. Luego las tartas se comprimen utilizando una prensa hidráulica.
Prensa de pistón horizontal: es una de las más eficientes, trabaja en baches. Sirve para prensar frutos rojos, nueces y vegetales.
Prensa Willmes: se utiliza comúnmente con jugo de uva. Es un sistema neumático que consta de un cilindro en el cual se deposita a la fruta y se rota para que se distribuya uniformemente, después se llena una bolsa con aire al interior del cilindro. Este proceso se repite varias veces aumentando la presión del aire en la bolsa.









HOMOGENIZACIÓN

Es muy importante obtener una muestra homogenea, en la que en todos sus puntoos, haya la misma concentración de vitamina C. esto se consigue con un ultraturrax por ejemplo.







FILTRACIÓN

En este paso se separan los fragmentos de pulpa y semilla que pasaron en el momento de la extracción. Se pueden usar decantadores y centrifugadores. El zumo de fruta aún con partes sólidas se introduce en decantadores para separar las partículas más grandes por precipitación. Pero este proceso de precipitado es lento, por lo que se pueden usar centrifugadores para que las partículas sedimenten más rápido. Se puede usar diferentes equipos de filtración: tierras de diatomeas, filtración con presión, filtración rotatoria con vaci. También se puede usar filtración con membranas: de membrana hueca y tubular, cerámica. Este último se usa con flujo horizontal sobre la membrana de cerámica y ofrece la ventaja de resistencia a la abrasión y tolerancia química.









CONCENTRACION
Concentrando el jugo, el procesador reduce el bulto del jugo, así reduciendo el volumen de almacenamiento. La concentración permite una deposición mas completa de sólidos insolubles.
El jugo es concentrado mediante la evaporación de agua, que es el mayor constituyente del jugo. Debido a la posible perdida de constituyentes del aroma, el primer paso es reabsorber los volátiles, de los cuales se puede recuperar el aroma. La deabsorcion es manejada primordialmente por la
evaporación parcial. Alternativamente, se puede emplear deabsorcion de vapor de agua.



PESADA

Una vez que tenemos la muestra preparada la debemos pesar antes de añadir los disolventes, para saber la cantidad de analito que hemos preparado. Para esto se pueden usar dos tipos de balanzas: gratatorias o analíticas (estas son las más precisas); dependendo de la precisión que se quiere para la pesada de la muestra.








DISOLUCIÓN

Para elaborar la disolución de los zumos se utiliza como disolvente el agua.